进行动物实验前需要对实验动物进行编号标记分组，这是一个重要的准备工作，对后期跟踪记录实验动物是很有必要的，但对动物编号标记的同时应保证编号不对动物生理或者实验产生影响，而且号码要清楚易认、耐久、便捷、适用，目前常用的方法主要有染色法、耳孔法、剪趾法[1]，另外还有目前市售的纹尾法、芯片法。之前常用的苦味酸染色法，比较方便适用、耐久，但苦味酸（2,4,6 三硝基苯酚）是炸药的一种成分，目前国家已经明文限制使用。以上各种标记方法均有优缺点，未能达到满意的效果，本文作者经过大量的筛选、分析比较，得出单色溴甲酚绿溶液对小鼠染色编号标记法比较符合编号各种要求，效果满意，从而为实验动物编号提供新的途径方法。 1 材料与方法 1.1 动物分组与饲养 SPF 级雌雄各半NIH 小鼠44 只，18～22 g，，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物质量合格证明编号：44007200064561。SCXK（粤）2018-0002]。饲养于屏障设施[SYXK（粤）2018-0002]。分成6 组：0.5%中性品红标记组、2%硝酸银液标记组、0.5%甲紫溶液标记组和2.5%溴甲酚绿液标记组各6 只，2.5%溴甲酚绿液染毒组20 只，动物实验经中心实验动物伦理委员会审查批准。 1.2 主要仪器和试剂 JEA3001 型电子天平，d=0.1 g，上海浦春计量仪器有限公司；90-1B 磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司。溴甲酚绿：批号：20170502；天津市天新精细化工开发中心； 1.3 染色液标记筛选 分别用0.5%中性品红、2%硝酸银液、0.5%甲基紫溶液和2.5%溴甲酚绿液(2.5g 溴甲酚绿加50%酒精定容至100mL)涂染相应组别的实验动物不同部位，涂染顺序从左到右、从前到后，左头部为1 号，左前肢为2 号、左腹部为3 号，左后肢为6 号，左侧为个位数，右侧为十位数，左右相加得到相应的号码，每组6 只，筛选出符合要求的染色液做小鼠经口急性毒性试验。 1.4 2.5%溴甲酚绿液小鼠经口急性毒性试验方法1.4.1 剂量设计：小鼠按20mL/kg 体重灌胃给予0.25 g/mL 供试品混悬液1 次，剂量为5000 mg/kg体重。 1.4.2 供试品配制方法：称取2.5g 受试物，加入少量0.5%CMC-Na 溶液研磨混匀，后加入0.5%CMC-Na 溶液至10 mL，即得浓度为0.25 g/mL 的受试物混悬液10 mL。 1.4.3 染毒：动物试验前，禁食过夜，不限制饮水。正式试验时，染毒组动物按20mL/kg 体重灌胃给予供试品混悬液，灌胃1 次，灌胃染毒后继续禁食约4h。 1.4.4 检测指标 染毒后，观察并记录中毒作用体征出现和消失时间和死亡时间。观察期为14 天。观察期内中毒死亡以及观察期满处死的动物均应进行大体解剖，肉眼观察，如发现组织或脏器出现异常，进一步作组织病理学检查。分别在第0、7、14 天称重。 1.4.5 结果判定方法 如试验期间出现小鼠死亡，需降低剂量或设计多个剂量重新进行试验；若无小鼠死亡，则认为供试品对小鼠的急性经口LD50＞5000 mg/kg 体重。根据急性毒性分级标准[2]（表1）对供试品的毒性进行评价。 表1 急性经口毒性的评价规定LD50(mg/kg) 毒性分级＜5 剧毒5～ 高毒50～ 中等毒＞500 低毒 1.5 统计分析 对动物体重进行统计处理并列表说明，原始数据以均数加减标准差表示（±s）。 2 结果 2.1 染色液标记筛选 0.5%中性品红、0.5%甲基紫溶液和2%硝酸银液标记小鼠维持2～3d，2.5%溴甲酚绿溶液标记小鼠维持20～30d。 2.2 2.5%溴甲酚绿液小鼠经口急性毒性试验 20只动物在灌胃后约33min 均出现全身变蓝，症状在d3 恢复。体重正常增长，未见动物死亡，LD50＞5000 mg/kg 体重。试验结束所有动物进行大体解剖，全部动物大体解剖肉眼观察未见异常（见表2）。 表2 溴甲酚绿对小鼠的急性经口毒性试验结果（±s）组别 剂量（mg/kg 体重） 性别 动物数 体重（g） 死亡率（%）d0 d7 d14染毒组 5000 ♂ 10 18.6±0.4 28.4±2.0 35.4±2.5 0♀ 10 18.6±0.4 24.9±1.7 28.6±1.9 0 3 讨论 目前常用的实验动物编号标记方法主要有染色法、耳孔法、剪趾法，另外还有目前市售的纹尾法、芯片法。耳标法同笼耳标容易掉落，导致号码混淆、成本较高；剪趾法会造成成年动物疼痛不适，与实验动物福利伦理不符，仅适用于新出生小鼠，市售的纹尾法、芯片法、进口标记笔法存在需要使用仪器或价格昂贵、操作不够方便、耗时等问题。 染色编号标记法是用化学药品在实验动物身体明显的部位，如被毛、四肢等处进行涂染，以染色部位、颜色不同来标记区分实验动物，是实验室常用、最容易掌握的方法，简单方便，不会给实验动物造成损伤和痛苦，但长时间实验会使涂染剂自行褪色，或由于实验动物互相嬉闹、舔毛、摩擦、换毛、粪尿和饮水浸湿被毛等原因，易造成染色标记模糊不清，另外，常用染色剂的毒性对实验动物的影响也是需要注意的问题。溴甲酚绿（3，3，5，5- 四溴间甲酚磺酰肽），是从植物中提取，灰绿色粉末，一般接触无毒，化学性质稳定，主要用作酸碱指示剂，PH=3.8 时呈黄色，PH=5.4时呈蓝色，PH=4.5 时开始有颜色明显变化。广泛用于相关酸碱指示[3～4]和血清白蛋白等临床检测（溴甲酚绿法）[5～6]，目前相关实验动物毒理学研究很少。本研究溴甲酚绿标记时间较长、简单清晰、便捷，小鼠经口试验评价为低毒，经试用于豚鼠、大小鼠等效果满意，期间可以节省动物标记操作大量时间，对动物不会造成损伤和痛苦。适用于小动物大样本，时间稍短的实验（慢性实验需要中途补充加深染色），是一种经济有效的大样本小实验动物标记方法。 [1] 霍勇,陈明等.心血管病实验动物学[M],北京,人民卫生出版社,2011 [2] GB/T 21603-2008 化学品急性经口毒性试验方法最大限量法; [3] 张梦,杭太俊,张正行,等. 溴甲酚绿酸性染料比色法测定黄杨宁软胶囊含量[J].药物分析杂志,2007,5(1):1-3. [4] 王淼,韩丽,谢兴亮,等. 苦参药材中总碱含量的溴甲酚绿比色法测定[J].时珍国医医药,2011,8(32):1-2. [5] 严志红,朱明芳,唐睿,等. 溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白[J].分析试验室,2009,9(1):1-3. [6] 李树华,庞定国,朱月武,等. 溴甲酚绿法测定血清白蛋白配方的正交实验及方法学评价[J].现在预防医学,2008,7(1):1-2. 进行动物实验前需要对实验动物进行编号标记分组，这是一个重要的准备工作，对后期跟踪记录实验动物是很有必要的，但对动物编号标记的同时应保证编号不对动物生理或者实验产生影响，而且号码要清楚易认、耐久、便捷、适用，目前常用的方法主要有染色法、耳孔法、剪趾法[1]，另外还有目前市售的纹尾法、芯片法。之前常用的苦味酸染色法，比较方便适用、耐久，但苦味酸（2,4,6 三硝基苯酚）是炸药的一种成分，目前国家已经明文限制使用。以上各种标记方法均有优缺点，未能达到满意的效果，本文作者经过大量的筛选、分析比较，得出单色溴甲酚绿溶液对小鼠染色编号标记法比较符合编号各种要求，效果满意，从而为实验动物编号提供新的途径方法。1 材料与方法1.1 动物分组与饲养 SPF 级雌雄各半NIH 小鼠44 只，18～22 g，，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物质量合格证明编号：44007200064561。SCXK（粤）2018-0002]。饲养于屏障设施[SYXK（粤）2018-0002]。分成6 组：0.5%中性品红标记组、2%硝酸银液标记组、0.5%甲紫溶液标记组和2.5%溴甲酚绿液标记组各6 只，2.5%溴甲酚绿液染毒组20 只，动物实验经中心实验动物伦理委员会审查批准。1.2 主要仪器和试剂 JEA3001 型电子天平，d=0.1 g，上海浦春计量仪器有限公司；90-1B 磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司。溴甲酚绿：批号：20170502；天津市天新精细化工开发中心；1.3 染色液标记筛选 分别用0.5%中性品红、2%硝酸银液、0.5%甲基紫溶液和2.5%溴甲酚绿液(2.5g 溴甲酚绿加50%酒精定容至100mL)涂染相应组别的实验动物不同部位，涂染顺序从左到右、从前到后，左头部为1 号，左前肢为2 号、左腹部为3 号，左后肢为6 号，左侧为个位数，右侧为十位数，左右相加得到相应的号码，每组6 只，筛选出符合要求的染色液做小鼠经口急性毒性试验。1.4 2.5%溴甲酚绿液小鼠经口急性毒性试验方法1.4.1 剂量设计：小鼠按20mL/kg 体重灌胃给予0.25 g/mL 供试品混悬液1 次，剂量为5000 mg/kg体重。1.4.2 供试品配制方法：称取2.5g 受试物，加入少量0.5%CMC-Na 溶液研磨混匀，后加入0.5%CMC-Na 溶液至10 mL，即得浓度为0.25 g/mL 的受试物混悬液10 mL。1.4.3 染毒：动物试验前，禁食过夜，不限制饮水。正式试验时，染毒组动物按20mL/kg 体重灌胃给予供试品混悬液，灌胃1 次，灌胃染毒后继续禁食约4h。1.4.4 检测指标 染毒后，观察并记录中毒作用体征出现和消失时间和死亡时间。观察期为14 天。观察期内中毒死亡以及观察期满处死的动物均应进行大体解剖，肉眼观察，如发现组织或脏器出现异常，进一步作组织病理学检查。分别在第0、7、14 天称重。1.4.5 结果判定方法 如试验期间出现小鼠死亡，需降低剂量或设计多个剂量重新进行试验；若无小鼠死亡，则认为供试品对小鼠的急性经口LD50＞5000 mg/kg 体重。根据急性毒性分级标准[2]（表1）对供试品的毒性进行评价。表1 急性经口毒性的评价规定LD50(mg/kg) 毒性分级＜5 剧毒5～ 高毒50～ 中等毒＞500 低毒1.5 统计分析 对动物体重进行统计处理并列表说明，原始数据以均数加减标准差表示（±s）。2 结果2.1 染色液标记筛选 0.5%中性品红、0.5%甲基紫溶液和2%硝酸银液标记小鼠维持2～3d，2.5%溴甲酚绿溶液标记小鼠维持20～30d。2.2 2.5%溴甲酚绿液小鼠经口急性毒性试验 20只动物在灌胃后约33min 均出现全身变蓝，症状在d3 恢复。体重正常增长，未见动物死亡，LD50＞5000 mg/kg 体重。试验结束所有动物进行大体解剖，全部动物大体解剖肉眼观察未见异常（见表2）。表2 溴甲酚绿对小鼠的急性经口毒性试验结果（±s）组别 剂量（mg/kg 体重） 性别 动物数 体重（g） 死亡率（%）d0 d7 d14染毒组 5000 ♂ 10 18.6±0.4 28.4±2.0 35.4±2.5 0♀ 10 18.6±0.4 24.9±1.7 28.6±1.9 03 讨论目前常用的实验动物编号标记方法主要有染色法、耳孔法、剪趾法，另外还有目前市售的纹尾法、芯片法。耳标法同笼耳标容易掉落，导致号码混淆、成本较高；剪趾法会造成成年动物疼痛不适，与实验动物福利伦理不符，仅适用于新出生小鼠，市售的纹尾法、芯片法、进口标记笔法存在需要使用仪器或价格昂贵、操作不够方便、耗时等问题。染色编号标记法是用化学药品在实验动物身体明显的部位，如被毛、四肢等处进行涂染，以染色部位、颜色不同来标记区分实验动物，是实验室常用、最容易掌握的方法，简单方便，不会给实验动物造成损伤和痛苦，但长时间实验会使涂染剂自行褪色，或由于实验动物互相嬉闹、舔毛、摩擦、换毛、粪尿和饮水浸湿被毛等原因，易造成染色标记模糊不清，另外，常用染色剂的毒性对实验动物的影响也是需要注意的问题。溴甲酚绿（3，3，5，5- 四溴间甲酚磺酰肽），是从植物中提取，灰绿色粉末，一般接触无毒，化学性质稳定，主要用作酸碱指示剂，PH=3.8 时呈黄色，PH=5.4时呈蓝色，PH=4.5 时开始有颜色明显变化。广泛用于相关酸碱指示[3～4]和血清白蛋白等临床检测（溴甲酚绿法）[5～6]，目前相关实验动物毒理学研究很少。本研究溴甲酚绿标记时间较长、简单清晰、便捷，小鼠经口试验评价为低毒，经试用于豚鼠、大小鼠等效果满意，期间可以节省动物标记操作大量时间，对动物不会造成损伤和痛苦。适用于小动物大样本，时间稍短的实验（慢性实验需要中途补充加深染色），是一种经济有效的大样本小实验动物标记方法。参考文献：[1] 霍勇,陈明等.心血管病实验动物学[M],北京,人民卫生出版社,2011[2] GB/T 21603-2008 化学品急性经口毒性试验方法最大限量法;[3] 张梦,杭太俊,张正行,等. 溴甲酚绿酸性染料比色法测定黄杨宁软胶囊含量[J].药物分析杂志,2007,5(1):1-3.[4] 王淼,韩丽,谢兴亮,等. 苦参药材中总碱含量的溴甲酚绿比色法测定[J].时珍国医医药,2011,8(32):1-2.[5] 严志红,朱明芳,唐睿,等. 溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白[J].分析试验室,2009,9(1):1-3.[6] 李树华,庞定国,朱月武,等. 溴甲酚绿法测定血清白蛋白配方的正交实验及方法学评价[J].现在预防医学,2008,7(1):1-2.

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